论文信息：KimJiHyun.,KimIckhee.,SeolYoung-Joon.,KoInKap.,YooJamesJ.,AtalaAnthony.,LeeSangJin.().Neuralcellintegrationinto3Dbioprintedskeletalmuscleconstructsacceleratesrestorationofmusclefunction.NatCommun,11(1),.
广泛性肌肉缺损的再生能力有限，常常需要进行重建性外科手术，并发症较多，愈合较差。模仿天然骨骼肌结构和功能特征的生物工程化骨骼肌构造成为新的选择。组织工程的重点是天然骨骼肌的结构组织，特别是肌肉细胞的单轴排列，这对于骨骼肌的收缩特性和产生有效运动是必不可少的。骨骼肌组织的有效神经整合仍然是一大挑战。天然骨骼肌组织通过建立神经肌肉接头(neuromuscularjunctions,NMJ)由周围神经系统神经支配，NMJ负责骨骼肌的存活，发育，成熟和收缩。生物工程化的骨骼肌构造物需要与宿主神经系统快速整合。因此，研究者拟通过生物打印人肌肉祖细胞(humanmuscleprogenitorcells，hMPC)和人神经干细胞(humanneuralstemcells，hNSC)来开发具有神经细胞整合的人骨骼肌构建体。
首先，为了验证神经细胞对骨骼肌分化的影响，将hMPC和hNSC共培养。先在二维共培养系统中优化骨骼肌细胞与神经细胞的比例，为下一步的三维生物打印实验做铺垫。已知骨骼肌细胞中较高的神经细胞成分可通过中断细胞融合来减少肌管形成，因此必须优化细胞比例以促进骨骼肌细胞成熟和组织发育以及NMJ形成。在分化培养基中，以不同比例的hMPC和hNSC评估肌管的形成和长期维持。进行肌球蛋白重链（myosinheavychain，MHC）的免疫荧光分析结果表明，在肌管形成和长期维持方面hMPC和hNSC的最佳比例为：1。与单纯hMPC相比，肌管的直径和长度，每根肌管的细胞核数以及横纹肌管的数目都显著增加（图1a-e）。hNSCs的胶质和神经元分化通过免疫荧光检测胶质原纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）和β-III微管蛋白（beta-IIItubulin，βIIIT）以及神经丝（neurofilament，NF）来确定（图1f）。NMJ的形成（βIIIT+/乙酰胆碱受体（acetylcholinereceptor，AChR）+/MHC+和NF+/AChR+/MHC+NMJs）证实了神经支配潜力（图1g）。与单纯hMPC相比，：1的hMPC和hNSC共培养，观察到肌管上AChRs表达增加并且与神经元共定位（AChR+/MHC+肌管）（图1i，j）。这些结果表明，骨骼肌细胞培养物中神经细胞成分的引入改善了肌管的分化和长期维持，hNSCs的神经元分化以及NMJ的形成。
图1.不同比例hMPCs和hNSCs在二维共培养系统中培养
接下来，将：1的hMPC和hNSC用于3D生物打印骨骼肌构建体（图2和图3a，b）。通过测量细胞生存力，肌管形成能力和NMJ形成来评估该构建体的生物性能。活/死染色分析显示，MPC+NSC组的细胞活力比MPC组高（图3c，d），并且在7天的培养期内，生物打印构建物中的细胞仍保持活力。与MPC组相比，MPC+NSC组MHC+肌管密度增加1.71倍，MHC+肌管长度增加证明肌管形成（图3e-g）。此外，生物打印构建体中的hNSCs分化为GFAP+神经胶质细胞和βIIIT+神经元（图3h，i），并且发现βIIIT+轴突与构建体的肌管上的AChR簇（NMJ）接触（图3j，k）。在MPC组中，在肌管上发现了少量AChR簇（图3l）。定量计算每个高倍视野的AChR（图3m）和NMJ（βIIIT+/AChR+）数目（图3n）。NMJs在突触传递和钙通道开放方面的功能由钙摄取成像确定。与MPC组相比，观察到MPC+NSC组的细胞内钙水平高的细胞数量增加。这些结果表明，与MPC组相比，具有hNSCs的生物打印骨骼肌构建体显示出基于AChRs预成形和NMJs形成的肌肉分化和成熟以及神经支配潜力的增加。
图2.人体骨骼肌的生物打印结构
图3.3D生物打印人体骨骼肌结构的体外评估
采用啮齿类动物广泛性肌肉缺损模型进行体内研究，将MPC和MPC+NSC的生物打印骨骼肌构建体植入缺损部位，以进行解剖和功能性骨骼肌再生。MPC和MPC+NSC组中生物打印的肌肉结构在植入后8周时恢复了几乎正常的胫骨前肌（tibialisanterior，TA）体积。与空白组相比，在生物打印的构建体组（MPC和MPC+NSC）中，TA的重量也有所改善。MPC+NSC组的肌肉重量在植入4周后迅速恢复（图4a）。植入后第4和第8周，通过体内功能分析评估了腓肠神经电刺激后伤肢的强直肌力量。根据肌肉力量测量结果，MPC+NSC组在植入8周时显示出完全的肌肉力量恢复，且MPC+NSC组明显优于MPC组（图4b）。因此，在生物打印的骨骼肌结构中引入神经细胞成分可以加速肌肉功能恢复。
图4.植入物对TA重量和肌肉力量的影响
使用组织学和免疫荧光分析在植入后第4和第8周评估了生物打印骨骼肌结构物中新形成的肌纤维，神经整合和血管形成。通过苏木精和伊红（hematoxylinandeosin，H＆E）以及Masson三色染色（Masson’strichromestaining，MTS）观察每组TA肌肉的微观结构（图5a）。MPC组和MPC+NSC组中，在缺损区域观察到具有最小纤维化组织向内生长的肌肉组织形成，从而维持了肌肉体积。定量测量每组的胶原蛋白沉积面积（图5b）。仅在MPC组和MPC+NSC组中观察到骨骼肌发育与整齐的肌纤维形成。
图5.组织学研究
为了研究生物打印骨骼肌构建体中的hMPC对肌肉再生的作用，使用MHC和人白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）的双重免疫荧光评估肌肉样本（图6）。MPC组和MPC+NSC组中，在植入后第4和第8周的缺损区域可见表达HLA的细胞（图6a），结果表明，生物打印结构中的植入细胞（HLA+）能够分化并形成肌纤维（MHC+/HLA+，白色箭头），高度对齐和组织良好的架构有助于肌肉组织再生。此外，将hNSCs引入生物打印的构建体（MPC+NSC）具有更大的形成MHC+肌纤维的能力，由MHC+肌纤维的面积百分比（图6b）和HLA+肌纤维的面积百分比证实（图6c）。结果表明，生物打印构建物中的hMPCs可以发育成熟，并最终形成增厚的肌纤维，同时保持组织结构，并且神经细胞成分可以促进骨骼肌再生。
图6.肌纤维的形成和成熟
为了研究生物打印骨骼肌构建体的神经支配能力，对NF/AChR/MHC和NF/AChR/HLA进行了三重免疫荧光检测。检查了在3D生物打印肌肉结构中植入的hMPC形成NMJs的能力（图7a，b）。MPC组中，在植入区域观察到周围神经NF+轴突与AChR+/MHC+肌纤维共定位，表明在生物打印的肌肉结构中宿主神经与新形成的肌纤维之间形成了NMJ。此外，植入区域中还存在HLA+细胞以及NF+/AChR+/MHC+肌纤维，证明hMPC能够分化为肌纤维并形成与宿主神经整合的NMJ。MPC+NPC组在植入的构建物中新形成的肌纤维上显示出成熟的NMJ和神经元接触（图7a，b）。在MPC+NSC组中，还观察到了植入的hNSC（βIIIT+/HLA+神经元）和与宿主神经（βIIIT+/HLA-神经元）接触引起的神经元分化（图7c）。表明植入的hNSC的神经元分化以及宿主组织和植入构建体之间的神经整合（βIIIT+/HLA-宿主神经元）。与MPC组相比，在MPC+NSC组中发现的NMJ和AChR簇数量更多（图7d，e）。与假手术组相比，NMJ+肌纤维百分比没有显着差异（图7f）。这些结果表明，生物打印的构造物中的肌肉细胞和神经细胞之间的相互作用改善了肌纤维在体内形成NMJ的能力。
图7.与3D生物打印骨骼肌结构的神经整合
最后，通过双重免疫荧光染色对血友病因子（WillebrandFactor，vWF）/α平滑肌肌动蛋白（alphasmoothmuscleactin，α-SMA）进行了检查，以了解植入结构的血管化情况。在MPC和MPC+NSC组中，基于vWF+/α-SMA+血管的整体染色，将生物打印的肌肉构建物植入肌肉缺损后高度血管化（图8a）。MPC组和MPC+NSC组较空白组显示出更多的血管数量和面积。但MPC组和MPC+NSC组之间没有显着差异（图8b，c）。
图8.3D生物打印骨骼肌结构的血管化
总之，引入神经细胞成分可以支持肌肉细胞长期存活，增强肌原性分化，并诱导生物打印的骨骼肌构建体中肌纤维上的NMJ形成，从而恢复啮齿类动物模型中正常的肌肉重量和功能。随着进一步的发展，这种生物工程化骨骼肌构建体有望成为治疗广泛骨骼肌缺损的新方法。
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