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基于整合策略的益心舒胶囊抗心肌细胞氧化应激损伤研究
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，氧化系统和抗氧化系统平衡紊乱，大量活性氧不断聚积，从而导致组织损伤，引发各种疾病。氧化应激参与心血管疾病的多个病理过程紧密相关，主要包括高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死和心力衰竭等，其中氧化应激过程中的活性氧能够导致DNA双链断裂、蛋白质失活、及脂质过氧化等一系列过程，导致心脏组织的结构破坏，兴奋-偶联收缩功能丧失，从参与了心血管疾病的演变和恶化。
图1氧化应激损伤通过多种途径导致心脏重构及心衰
益心舒胶囊（YXS）是由人参，麦冬，五味子，黄芪，丹参，川芎，山楂等7味药组成的中成药，临床广泛用于气阴两虚，瘀血阻脉所致的胸痹、胸痛、胸闷、心悸气短、脉结代、冠心病心绞痛见上述证候者，并取得了良好的疗效。然而，益心舒胶囊治疗心血管疾病的分子机制尚不明确。前期研究发现益心舒胶囊具有良好抗氧化应激损伤的效果，且其抗氧化应激损伤的作用与其治疗心血管疾病紧密相关。转录因子（transcriptionfactor,TF）在心血管疾病中具有重要的调控作用（转录因子是一类能与基因5`端上游特定序列结合，启动下游基因表达的蛋白质）。本次研究运用大规模筛选转录因子的catTFREs蛋白质组和RNA-sq转录组测序技术结合，并进一步结合网络药理学的方法，构建多组学整合研究策略，探究YXS抗氧化应激损伤中的关键转录因子，一方面为心血管疾病寻找新的潜在治疗靶标，另一方面从分子层面阐释YXS治疗心血管疾病的分子机制。
1.益心舒胶囊（YXS）具有明显的抗氧化应激损伤作用
益心舒胶囊（YXS）具有明显保护心肌细胞免受氧化应激损伤的作用，主要体现在增加细胞生存率、提高抗氧化酶活力、维持细胞膜电位、降低活性氧、和降低细胞凋亡等。
图2YXS抗H2O2诱导氧化应激所致心肌细胞损伤，具有提高细胞存活率、增强抗氧化酶活性、减少ROS和MDA产生及降低细胞凋亡等作用
2.益心舒胶囊抗氧化应激损伤转录因子大规模定量分析
使用catTFREs方法共鉴定出TF，其中模型组相比对照组激活57个TF（倍数变化2）和抑制51个TF（倍数变化0.5）。与模型组相比，YXS激活34个TFs并抑制36个TF。生物功能的分析表明，过氧化氢处理后，激活了参与染色质重塑、伤口反应和rRNA加工等生物学过程的TF（图3A中的蓝点），而抑制血管生成和凋亡过程相关的TF。与模型组相反，YXS激活TFs涉及内质网应激反应、炎症反应、细胞增殖、碱切除修复和血管生成，同时抑制参与凋亡过程、染色质重塑和胰岛素代谢过程相关的TF。进一步分析显示，与细胞凋亡相关（GO：，GO：和GO：）共有48TFs，网络分析表明，凋亡相关的TF相比非凋亡相关的TF具有更大的网络连结度（5.85vs2.83，p=0.），表明凋亡相关的TF在调节网络中占据重要的位置。
图3采用catTFREs方法对转录因子进行大规模定量分析；（A）TF活性水平整体情况，黄色点代表具有显著性差异的TF，蓝色点代表没有显著差异的TF；（B）转录因子的调节网络图，并对凋亡TF和非凋亡TF的网络进行比较。
3.益心舒胶囊抗氧化应激损伤的转录组分析
通过RNA-sq技术研究YXS抗氧化应激损伤的基因表达。该方法显示，通过YXS可以挽救过氧化氢带来的基因下调（图4A）。如过氧化氢处理有个显著下调基因和52个上调基因。YXS处理后显著上调个基因，下调个基因。聚类分析发现YXS上调DNA修复相关过程，如DNA修复、DNA完整性检查点、细胞周期检查点、有丝分裂DNA损伤检查点和MCM复合物，同时下调凋亡相关过程如染色质组装、DNA构象变化、凋亡过程、对氧化应激的反应、炎症反应、TNF信号通路、MAPK和JAK-STAT级联反应。YXS通过下调生物过程如凋亡和细胞死亡，同时上调参与DNA修复、细胞周期和DNA损伤检查点的基因，来抵抗过氧化氢导致的损伤。
图4采用RNA-sq转录组测序技术对基因水平进行定量分析;（A）基因表达整体水平变化；黄色代表差异表达的基因，而蓝色的代表的基因差异不显著；（B）聚类分析；（C）模型组与对照组比较和（D）YXS组与模型组比较富集的生物学过程
4.益心舒胶囊抗氧化应激损伤整合研究策略的构建I（整合蛋白质组与转录组）
为了鉴定过氧化氢损伤中关键TF，基于TF调控的方向、自身变化水平和下游基因的表达水平，构建TF自身活性水平与其下游靶基因表达水平的关系图（图5）。值得注意的是，过氧化氢处理后大多数激活TFs被抑制，并且大多数抑制TFs被激活。YXS作用后，激活6个TFs，4个TFs被抑制，表明YXS在转录因子水平上有回调作用（图5）。在不同情况下的TF调控网络如图6所示。与对照组相比，模型组中63个TF（蓝色节点）显著改变。与模型组相比，YXS有22个TFs发生显著改变，其中12只TFs（黄色节点）仅在YXS组与模型组相比时发生改变，10个TF（粉色节点）为共同调节的TF。因此，通过整合TF活性及其下游基因表达，将这10种共同调控的TF初步鉴定为过氧化氢诱导氧化应激损伤中的重要的转录因子。
图5根据TF调控方向、自身变化水平和TFs靶基因表达水平，构建了对过氧化氢诱导的氧化应激反应中关键TFs及其靶基因的相关性图。黄色节点指起激活作用的TFs;蓝色节点指起抑制作用的TFs。
图6通过CllNt的TF-TG调控关系确定转录因子（TF）及其差异表达靶基因（TG）的调控网络。（A）与对照组相比，过氧化氢处理后显著改变的TF-TG调节网络。（B）与模型组相比，YXS处理后的TF-TG调节网络，蓝色指仅在模型组与对照组相比显著改变的TFs，黄色指仅在YXS与模型组相比显著改变的TF，粉色指模型组与对照组和YXS与模型组中，共同调节的TFs，而添加星号表示涉及凋亡过程的TFs。
5.益心舒胶囊抗氧化应激损伤整合研究策略的构建II（网络药理学分析）
通过YXS化学成分与其潜在目标构建成份-靶标之间的关系网络，进一步鉴定出重要的TFs，构建了由潜在目标（24个转录辅因子和33个关键TFs）和YXS化学化合物（15个化合物）组成的网络关系图。值得注意的是，之前筛选出来的10个TFs中，7个TF与YXS的化学成分有相互作用，包括DNA(无嘌呤/无嘧啶碱基位点)裂解酶（Apx1）、前B细胞白血病转录因子3（Pbx3）、α-珠蛋白转录因子CP2（Tfcp2）、同源盒蛋白Hox-D13（Hoxd13）、DNA甲基转移酶1相关蛋白1（Dmap1）、芳烃受体核转运子（Arnt）和同源盒蛋白Mis1（Mis1）等。
图7YXS中化合物与TFs及其辅因子的相互作用网络。在这个网络中有两种类型的相互作用，YXS（粉色）化合物与TF辅因子（蓝色）的相互作用是潜在的药物-靶标相互作用，辅因子（蓝色）和TF（黄色或红色）之间的相互作用是来自STRING中蛋白质-蛋白质相互作用（置信度≥0.5），红色节点表示进一步筛选出来的关键TFs。
6.益心舒胶囊抗氧化应激损伤关键转录因子活性验证
分别在H9C2细胞系和人源干细胞诱导心肌细胞中对其中的关键转录因子如Apx1和Pbx3进行验证，发现Apx1和Pbx3的活性变化趋势与catTFREs的结果一致，YXS能够逆转过氧化氢引起的Apx1和Pbx3活性下降，并且进一步分析转录因子下游基因表明，其下游基因的变化趋势与转录因子变化趋势基本一致，且转录因子下游的基因主要集中在DNA修复和抗凋亡上。
图8YXS能够上调过氧化氢诱导H9C2细胞氧化应激损伤中，Apx1和Pbx3的活性变化及其下游基因表达情况。（A）Apx1（绿色）和（B）Pbx3（绿色）免疫荧光染色，F-肌动蛋白（红色），细胞核（蓝色）（C）Apx1和（D）Pbx3的下游靶基因表达，Apx1和Pbx3的靶基因均受相应的TFs正调控。
图9整合研究策略的研究流程图
本研究成功构建了一套整合组学研究方法，首先运用大规模筛选转录因子catTFREs方法和转录组测序（RNA-sq）技术对转录因子和下游基因水平进行定量分析，通过生物信息学方法整合蛋白质组和转录组数据（基于转录因子自身活性变化、调控方向和靶基因的表达水平，构建转录因子-靶基因关系图）初步鉴定出10个重要的转录因子，进一步结合网络药理学构建成份-靶标关系，进一步筛选出7个潜在关键TF，由此构建出一套整合研究策略，筛选出YXS抗氧化应激损伤中的潜在的关键转录因子，不仅从分子层面阐释益心舒胶囊作治疗心血管疾病的分子机制，而且为心血管疾病提供新的潜在治疗靶标，另一方面本研究方法还可用于其他复杂疾病的分子机制研究。
研究成果于年10月以“Scrningandidntificationofcriticaltranscriptionfactorsinvolvdinthprotctionofcardiomyocytsagainsthydrognproxid-inducddamagbyYixin-shu”为题在线发表在ScintificRports。本研究工作得到国家重大新药创制重大专项、国家自然科学基金委等有关项目的资助。中国中医科学院中药研究所中药新药设计课题组的张晶晶、耿亚和郭非非为该文章的第一作者。
[1].AmJPhysiolHartCircPhysiol.Dc;(6).
[2].Scintificrports.,Oct;(7).
中国中医科学院中药研究所中药新药设计课题组主要从事中药新药设计技术与应用、基于整合药理学策略的中药复杂系统作用解析研究、中成药大品种培育研究。
课题组拥有多学科人才队伍，博士后与研究生培养成效显著。课题组的博士后5人，其中，4人获得国家自然科学基金项目（2个面上、2个青年基金），2名出站博士后均分配到高校工作；组内研究生获得中华中医药学会全国优秀博士论文2项，2人获得中国中医科学院优秀毕业论文一等奖，1人获得二等奖。
中药新药设计组重视中医药科研工具的开发与推广应用。其中，中医传承辅助平台（TCMISS），成为中医传承领域应用最为广泛的专属软件，成为中药饮片层次用药规律分析得力工具；整合药理学研究平台（TCMIP），是进行的“中药方剂-化学成分-网络靶标-药理作用”一站式分析工具，从分子层次上诠释中药复方的药效物质及其分子机制的得力工具，日益受到
