作者:浦介麟(中国医学科医院)
关键词：参松养心胶囊心律失常心肌细胞
参松养心胶囊是由十几种中药组成的复方制剂，方中多数药物均有较好的抗心律失常作用。在动物模型的研究报道，参松养心胶囊能明显抑制药物诱发的心律失常并对缺血再灌注所致心律失常有明显的保护作用。也有随机双盲临床试验显示，参松养心胶囊对治疗冠心病心律失常有明显疗效。但未见对心肌细胞离子通道影响的报道。本研究采用全细胞膜片钳记录技术,探讨了参松养心胶囊对豚鼠单个心室肌细胞离子通道L型钙电流和钠电流的影响,了解其作用的电生理机制，为其临床应用进一步提供理论和实验依据。
1材料和方法
1.1材料
1)试剂参松养心胶囊提取干粉，由石家庄以岭药业有限公司提供。II型胶原酶(collagenaseII)为Gibico公司产品。链蛋白酶E为Merck公司产品。N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、乙二醇-双四乙酸(EGTA)、氯化铯(CsCl)、谷氨酸(L-Glutamicacid)、牛磺酸(Taurine)、天门冬氨酸、磷酸肌酸二钠、氯化胆碱(Choline-Cl)、CaCl2、Na2ATP、K2ATP、MgATP、CsOH为Sigma公司产品。氯化四乙胺(TEA-Cl)、4-氨基吡啶(4-AP)、为Fluka公司产品。河豚毒素(TTX)为Affiniti公司产品。其余试剂为国产分析纯，由北京化学试剂公司提供。
2)溶液
①无钙台氏液(mmol/L)：NaCl、KCl5.4、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES10、Glucose10，用NaOH调pH至7.4。
②KB液(mmol/L)：KCl40、KH2PO、MgSO43.0、KOH80、L-谷氨酸50、牛磺酸20、HEPES10、Glucose10、EGTA0.5，用KOH调pH至7.4。
③记录全细胞钠电流的细胞外液(mmol/L)：NaCl5.0、MgCl21.2、CsCl5.0、TEA-Cl、HEPES20、Glucose11、4-AP3.0、CaCl20.5、CoCl20.5，用CSOH调pH至7.3。所有电极内液均经过直径0.22μm微孔滤膜过滤。
④记录全细胞钠电流的电极内液(mmol/L)：CSOH、天门冬氨酸、TEA-Cl20、HEPES10、MgATP5.0、EGTA10、磷酸肌酸二钠3.6，用CsOH调pH至7.3。
⑤记录全细胞钙电流的细胞外液(mmol/L):Choline-Cl、CaCl22.0、MgCl21.0、CsCl4.6、TEA-Cl10、HEPES5、Glucose10、4-AP5.0，用CSOH调pH至7.3。
⑥记录全细胞钙电流的细胞内液(mmol/L)：CsCl、MgCl23、HEPES10、EGTA10、Na2ATP5，TEA-Cl.10，用CsOH调pH至7.3。用0.22μm微孔滤膜过滤。
⑦参松养心胶囊药物溶液：将参松养心胶囊提取干粉，分别用不同的细胞外液配制成不同的质量百分比浓度溶液，并离心取上层溶液。
3)动物成年豚鼠，雌雄不限，体重-g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供1.2方法
1.2.1单个豚鼠心肌细胞的分离
参考文献并加以改进，用急性酶解法制备心室肌单个细胞。取豚鼠用50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开胸取出心脏，在4℃无钙Tyrode液中去除脂肪和心包膜，分离主动脉并插管(见图1)，行Langendorff心脏灌流，速度为6～8ml/min。先以无钙台氏液灌流3min(灌注压为20cm水柱)，洗净冠脉内血液，再用低钙酶解液(CaCl2为0.1mmol/L低钙台氏液,含Ⅱ型胶原酶0.4mg/ml，蛋白酶E0.04mg/ml)循环灌流，大约15～20分钟后，将心脏从Langendorff装置上取下，置入室温KB液中，剪去心房和基底部的组织，持眼科镊将心室组织轻轻撕拉，用粗开口的吸管缓慢吹打，使心肌细胞从心肌组织上脱离，获得单个心室肌细胞,上清液用目的过滤网过滤，心肌细胞收藏在含KB液的试管中。整个灌流系统温度保持在37℃，所有的灌流液和KB液均通以%的O2饱和30分钟以上。将细胞在室温下静置一小时左右复钙至0.25mmol/L，室温保存备用。
图1Langendorff灌流系统
1.2.2全细胞膜片钳实验记录
实验前吸取少许富含细胞的KB悬液于0.5ml的灌流槽中，静置5～10min，待细胞沉底附壁后，用%O2饱和的细胞外液进行表面灌流5～10min，流速2～3ml/min。在倒置显微镜(OLYMPUSIX70)下选择边缘清楚，表面光滑，横纹清晰，无收缩的细胞。实验在22～24℃室温下进行。采用Hamill等人[8]的标准全细胞膜片钳记录方法，在电压钳制模式下记录通道电流。膜片钳放大器(AxopatchB，美国Axon公司)，通过A/D和D/A数据转换器(Digidata0，美国Axon公司)同计算机相连接。刺激信号及电压、电流输入信号的采集均由软件(pClampex7.0，美国Axon公司)控制。玻璃毛胚管(中国科学院物理所提供)经微电极拉制仪(p-97，美国sutter公司)由4步拉制而成，经抛光仪(MF-，日本NARISHIGE公司)抛光后尖端直径2～3μm。充灌电极内液后入水电阻为1～2MΩ，补偿液接电位后，调节三维操纵器(MHW-3，日本NARISHIGE公司)使电极尖端移向细胞表面，形成高阻封接(gigaseal)，封接电阻为1GΩ以上。补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式。电容测定时给予-10mV阶跃的刺激，用Cm=τ?Iss/△V求膜电容。调节慢电容补偿和串联电阻补偿80%～90%以减少瞬时充放电电流和钳位误差。信号经截止频率为1kHz的四阶贝塞尔低通滤波器，采样率为10kHz。
在记录时，为避免电流的衰减(rundown)现象影响，电极内液中加入ATP，并控制实验在细胞破膜后25min内完成。根据实验设计，将配制好的不同浓度的药物溶液，用恒流蠕动泵以2ml/min的速度向细胞灌流槽分别灌流，同时使用整负压吸引装置将废液从灌流槽吸除。记录方法为破膜后稳定5min记录给药前的电流值，给药5min后分别记录不同浓度药物作用下的电流值。采样后数据存贮在电脑硬盘内，供测量及分析用。为消除细胞间误差，电流值以电流密度(pA/pF)表示。
1.2.3各电流刺激方案设定及观察指标
1)记录INa时刺激方案：维持电位(Vh)-mV，指令电位-mV~+40mV,阶跃10mV,钳制时间30ms,刺激频率0.2Hz;以测试电压-20mV的INa峰值电流密度在用药前后的变化作为观察指标;2)记录ICa时刺激方案：维持电位(Vh)-70mV，指令电位-60mV~+60mV,阶跃10mV,钳制时间ms,刺激频率0.2Hz;以测试电压10mV的ICa峰值电流密度在用药前后的变化作为观察指标;3)为避免长时间记录时Rundown现象对实验结果的影响设立空白对照组,即相同条件下引出INa、ICa，L后以不含药物的细胞外液灌流,每5min重复实验一次,仍以INamax、ICa，Lmax作为观察指标。
1.3数据分析与统计
原始电流数据采用Clampfit8.0(美国Axon公司)进行测量采集，使用Origin6.0数据处理软件(美国MicrocalSoftware公司)对采集后数据进行分析、拟合和作图。实验数据以均数±标准差()表示，给药前后采用配对t检验，P0.05认为有显著性差异。
2.结果
2.1参松养心胶囊对豚鼠心肌细胞膜INa的作用
使用INa细胞内外液和刺激方案，在豚鼠心室肌细胞上能记录到一快速激活、快速失活的内向电流。膜电位从-50mV开始激活，峰值电位在-2mV左右，反转电位+20mV左右。电流在1~3ms内达到高峰，其激活和失活过程均呈电压和时间依赖性。该电流能被30μmol/L河豚毒素(TTX)完全阻断，表明该电流为INa。该电流在破膜20分钟内无明显衰减现象(见图2)。
图2INa最大峰值电流密度与时间关系曲线横坐标为破膜后时间，纵坐标为INa最大峰值电流密度，电流在破膜后20分钟内没有明显衰减
用钠外液溶解参松养心胶囊提取干粉配制成的0.5%溶液，对INa有抑制作用。用药前平均峰值电流密度为27.21±5.35(PA/PF)，用药后平均峰值电流密度为14.88±2.75(PA/PF)，平均抑制率为44.84±7.65%(n=5,P0.05)。药物在每一指令电压水平上都减小INa电流密度，但基本不改变激活电位、峰电位、反转电位和曲线的形状。(图3-5)
图3参松养心胶囊对INa电流的影响A，control;B,药物浓度0.5%时对INa有抑制作用
图4参松养心胶囊对最大INa峰值电流的影响A,control;B,给予0.5%浓度药物后在-20mV记录的INa峰值电流受抑制。
图5参松养心胶囊对INa电流密度-电压关系的影响给药后，在不同钳制电压下均使INa峰值电流受抑制，表现为电流密度-电压曲线上移
2.2参松养心胶囊对豚鼠心肌细胞膜ICa的作用
使用ICa-L细胞内外液和ICa-L刺激方案在豚鼠和大鼠心室肌细胞上均能记录到一快速激活、缓慢失活的内向电流。从-30mV开始激活，峰值电位在0～+10mV，反转电位+50～+60mV。电流在10ms左右达到高峰，24ms基本完全失活。其激活和失活过程均呈电压和时间依赖性。该电流能被0.2mM的CdCl2完全阻断，表明该电流为ICa-L。此电流在20分钟内无明显衰减(见图6)。
图6ICa最大峰值电流密度与时间关系曲线横坐标为破膜后时间，纵坐标为ICa最大峰值电流密度，电流在破膜后20分钟内没有明显衰减
以测试电压为+10mV引出的ICa-L峰值电流作为观察指标。分别观察用钙外液将参松养心胶囊干粉配制成1%,0.5%,0.25%浓度溶液时，对豚鼠心室肌细胞ICa-L的影响。结果显示参松养心胶囊药物溶液以浓度依赖性抑制ICa-L峰值，将给药后ICa-L值与给药前ICa-L进行比较,各浓度组差异均有显著性(表1，图6，7)。药物在每一指令电压水平上都减小INa电流密度，但基本不改变激活电位、峰电位、反转电位和曲线的形状(图8)。
图6参松养心胶囊对ICa-L的影响A，给药前;B，给予药物浓度0.5%时对ICa-L有抑制作用。
图7参松养心胶囊对最大ICa,L峰值电流的影响A,control;B,给予0.5%浓度药物后在+10mV记录的INa峰值电流受抑制。
图8参松养心胶囊对ICa电流密度-电压关系的影响给药后，在不同钳制电压下均使ICa峰值电流受抑制，表现为电流密度-电压曲线上移
3讨论
多种跨膜离子流的复杂变化产生心肌细胞的动作电位和静息电位，即动作电位和静息电位是多种离子通道综合作用的结果，细胞膜离子通道电流的异常改变是形成各种心律失常的最重要因素。膜片钳技术可直接测定膜离子通道电流的大小,是研究药物对离子通道活性影响的最为直接的手段。
本实验结果表明:参松养心胶囊干粉溶液对INa峰值电流有抑制作用，同时对ICa，L具有一定程度的浓度依赖性阻滞作用。参松养心胶囊可以使两种电流的电流密度-电压曲线均上移,但不改变峰值、激活和反转电位,提示参松养心胶囊在不同膜电位水平对INa、ICa，L均具有一致的阻滞作用。
INa形成快反应动作电位的0相，是影响心肌兴奋性、不应性和传导性的重要离子流。抑制了INa可能引起细胞自律性和传导性的下降，发挥其抗心律失常的作用。ICa，L是动作电位2相的主要离子流，对动作电位的时程起重要作用。同时ICa-L也是触发细胞内钙的释放引起心肌收缩偶联的主要离子流，细胞内钙超载是心肌缺血再灌注损伤的中心环节。抑制心肌细胞L型钙通道,是抗心律失常的重要机制之一，而且降低钙内流可减轻细胞内的钙超载,对心肌起保护作用。有试验证实参松养心胶囊能改善心肌缺血和对缺血心肌具保护作用,并能对抗哇巴因引起的触发性心律失常,这些均可能与参松养心胶囊阻滞ICa，L有关。参松养心胶囊是由多味中药组成的复方制剂，具有复杂的成分，它对INa、ICa，L的抑制作用可能仅为其药理机制的一部分。
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