针灸,可能是通过结缔组织在起作用
原作者：HeleneM.Langevin,DavidL.Churchill,JunruWu,GaryJ.Badger,JasonA.Yandow,JamesR.Fox,andMartinH.Krag，原文刊登于年FasebJournal16卷8期-页.
译者：李康
摘要：在操作针灸针时会导致一种力学变化，即起针阻力增加，需要用力才可以从组织取出针体，这种现象称之为“滞针”（needlegrasp，通常患者自觉针下出现酸、麻、胀、重等甚或沿着一定部位、向一定方向扩散的感觉，医者感到针下有徐和或沉紧的感觉，“如鱼吞钩饵之浮沉”）。本研究探讨结缔织的盘绕是滞针的主要原因，而不是肌肉组织的收缩。
实验步骤：
1)、比较针灸针未刺入肌肉组织与刺入肌肉组织的起针阻力大小；
2）、在大鼠麻醉状态下施行捻转手法与否，针体周围结缔组织体积和起针的阻力；
3）、施行捻转手法与否，比较显微超声技术下的大鼠腹壁组织成像。
我们发现：
1）起针阻力方面，肌肉组织的针刺刺激量增加没有明显变化，而皮下组织的针刺刺激量增加有明显变化；
2）通过针体捻转，针体周围结缔组织体积与起针阻力都增加；
3）针体捻转后，皮下组织中螺旋形有序结构增加较明显。
关键词：生物力学皮下组织机械应力超声组织学
医学科学界的一个重要议题就是，是否支持世界上相当比例人口使用的医学替代疗法。许多这样的疗法，声称有效是建立在一些现象基础上的，这些现象通常用现有的生理学知识能够很难解释（如传统针灸学认为针刺疗效是以得气为基础的）。肯定或否认这些认识，需要对这些现象进行客观研究。若果这些现象无法得到证实，必将阻碍建立在错误认识基础上的治疗方法实施；如果这些现象可以被证实并得到客观的研究，这将为替代医学的生理或基础研究带来新的视角。
在中国针灸已有两千多年的历史，现在在西方也变得越来越受欢迎。在过去的20多年，研究人员不断地研究针灸等替代疗法，但针灸疗效的生理基础仍然未知。目前仍无法解释针灸过程中的特征性反应“得气”。广泛认为针灸取效必须得气，得气包含着患者经历的感觉反应，例如针体区域疼痛感觉，同时伴随针灸师手下感觉到针体周围组织在收缩，针体的捻转阻力增加（如鱼吞钩饵之沉浮），我们把得气的生物力学成分称之为滞针。
起针阻力为把针从组织中取出所需的力，通过测量起针阻力大小来客观量化滞针。临床上通过捻转、提插等针灸手法来加强滞针。我们使用自动针灸针刺仪器，针刺捻转后显示显著增加起针阻力。实际上，通过捻转，起针阻力可以达到4.9N（相当于g重量），因此滞针是一个与针灸针刺手法有关并且可以被测量到的机械生物力学现象。
被文献频繁引用的滞针的生理原因是因为骨骼肌的收缩，然而实验数据并不支持这一说法。因此我们提出一个有别于上述的新的假说，滞针主要和结缔组织相关，与肌肉组织关系不大。我们提出，针刺手法捻转后，结缔组织盘绕，针与结缔组织之间形成一个紧密的机械耦合，针刺手法就可以把机械信号传递到组织。这个假说得到组织学的支持，在实验大鼠组织内，发现针刺捻转后，皮下组织显著增厚和致密结缔组织盘绕。我们也提出机械信号传导的后续效果，包括基因表达与细胞外基质成分的改变，这或许可以解释针灸的局部和远端以及远期效果。
在这项研究中，我们采用三个互补实验方法，来验证我们的假说，即针刺捻转后增加起针阻力原因是结缔组织的缠绕而不是肌肉组织的收缩。
第一、我们研究在滞针过程中，肌肉组织和结缔组织的作用。控制针刺深度来针刺健康受试者，分别刺入肌肉组织与皮下结缔组织后，测量起针阻力；、
第二、我们研究针刺捻转对起针阻力和针刺区域皮下结缔组织厚度的影响；对活体麻醉大鼠一组针刺施行捻转手法，另一组未施行捻转手法，分别测量起针阻力，紧接其后快速组织固定，在连续组织切片标本上测量致密结缔组织体积；
第三，我们研究捻转手法对皮下组织结构图案影响，我们使用高频超声扫描声学显微镜对捻转组和未捻转组大鼠腹壁组织观察，获得高分辨率图像。基于之前的研究，施行捻转手法后组织学观察表明组织内出现螺旋结构图案，我们提出由皮下胶原蛋白、脂肪、弹性蛋白、细胞外基质等结缔组织产生的声学图案表明针刺捻转后皮下组织螺旋形有序增加。
实验方法
受试者报告
本实验是一份由年龄18-55岁60名健康人参与的研究中的一部分，该研究已通过佛蒙特大学机构审查委员会审核。排除标准和受试者特征在它文中已经描述过，不在赘述。针灸有多种不同的行针方法，本研究采用下面三种针刺手法，即双向捻转（BI）、单项捻转（UNI）、无捻转（NO）。在签署知情同意书后，受试者随机分为三组，即BI组、UNI组、NO组，每组之间只有行针手法的不同。在实验期间，每名受试者身体两侧，十处不同部位接受针刺。其中八处是在上肢和下肢，用来比较传统针灸穴位与非针灸穴位的不同；其余两处在腰部和骶部，作为本次实验对象，这两个穴位由皮肤标志法定位出来，腰上针刺点平第二、三腰椎之间，旁开后正中线5cm，骶部针刺点平第一骶后孔，旁开后正中线10cm。
本实验目的是确定肌肉组织还是皮下组织导致滞针。我们充分利用大多数受试者骶部皮下组织较腰部多。对每一个受试者和选取的针刺点，我们随机在机体两侧采用两种不同的针刺深度（D，D+1），D就是由超声探测到的皮下组织厚度，D+1就是D加上1cm。Acuson超声机配备有7兆赫的线性阵列传感器，传感器垂直于皮肤，以获得超声图像。在超声图像上，肌肉表面筋膜表现为不同回声特性和压缩性的回声线（皮下组织和肌肉）。骶部皮下组织厚度至少比腰部大1cm。因此在骶部的针刺SD、SD+1只刺入皮肤及皮下组织，而腰部LD+1要刺入肌肉1cm。如图1。
图1
受试者针刺过程及起针阻力测量
针刺、行针手法、起针阻力测定都由计算机控制的针刺机器来实施，关于这个机器它文已述，本文不再赘述。单方向针体旋转（UNI）是顺时针旋16圈，双向旋转（BI）是顺时针和逆时针交替旋转16圈，无旋转组（NO）不用旋转。除了针刺深度之外，其他所有针刺参数保持不变。进针速度为8mm/s，旋转速度为8转/秒，操作前针停留2秒，操作后针停留10秒，起针速度是5mm/s。这些参数都是模拟训练有素的针灸师操作而设定的。
动物活体起针阻力与结缔组织体积测量
动物实验程序均获佛蒙特大学动物护理及使用委员会批准。13只重量在-g的雄性大鼠使用2%异氟醚麻醉。在大鼠腋中线上，把针灸针刺到胸廓下端与髋关节之间。针刺参数设置除了起针速度为1mm/s,其他与上相同。为了防止针刺入腹腔脏器，在进针之前，在腹壁中线做一切口，沿腹壁里面植入一海绵。腹壁两侧随机顺序针刺，随机分为单项旋转或无旋转组。单项旋转组旋转32圈。针刺入深度保持在32mm。在针刺过程中，针灸针穿过腹壁的全层组织。在针刺完毕之后，把仍处在麻醉状态下的大鼠处死。然后把大鼠标本浸泡、固定在10%福尔马林溶液中24小时。再固化后，切取大鼠标本上的包含针体区域的2cm×0.5cm大小的组织块。针刺痕迹用1:1的印度墨水与聚乙烯乙二醇混合物标记。取出的组织块进行组织学处理，垂直于皮肤方向每层厚度10um连续切片，再HE染色。在老鼠体内，皮下组织是位于皮下肌与腹壁肌肉之间。图2
大鼠腹壁组织外植体的制备
八只大鼠在麻醉状态下处死后，沿大鼠腹部剑状突起至耻骨联合做一切口，然后解剖大鼠腹壁，获得一10×15cm大小组织块，包括含有皮下肌肉的皮下组织，处理完之后放入缓冲液中。该大鼠腹壁两侧随机分为单方向旋转组（UNI）、无旋转组（NO）。在腹壁两侧，以大鼠最后一肋和距后背正中线4cm的交点为中心，切取半径为2cm的组织标本，手术结束后，把标本皮下组织面放在有机玻璃定制的组织支架上。样品用缓冲液冲洗，垂直于皮肤的针灸针通过背部板和组织样本的中心。如图2所示。对单向捻转组捻转的圈数是32圈，而无捻转组捻转的圈数是零。
超声扫描技术
扫描声学显微镜的框图如图2所示，在这项研究中使用的是由加拿大多伦多大学生物物理系研发的50MHZ聚焦换能器，传感器的孔径和焦距分别为2毫米和2.25毫米，MHz带宽的脉冲发生器/接收器（参数：模型pr和rpp，Waltham，MA）在脉冲回波模式驱动这个传感器。当启动传感器是，传感器发出短的脉冲波，同时也收集从组织反射和散射会来脉冲波。接收回来的脉冲波的无线电频率被放大，以MHZ和8-bit分辨率进行数字化。
传感器和标本架在室温下沉浸在纯水中，标本架固定不动，传感器安置在三维精密运动系统上，在计算机控制下该系统能够转换信号。运动系统Z轴垂直于样本表面，传感器的Z轴可以调整以使超声聚焦在表面下um聚脂薄膜窗组织面。数据收集门时间可以调整以使组织产生的回声才能被收集，由聚脂薄膜和底板产生的特征峰被排除在外。研究人员采取盲法调整来研究这些差异（单向捻转组与无捻转组）。在大鼠腹壁组织，皮下组织厚度约为um，通过捻转就可以增加几个毫米。传感器的聚焦区域在捻转样本和无捻转样本的皮下组织内。一旦传感器的Z轴建立起来，就不允许在扫描过程中改变。
为了获得图像，传感器在XY面进行信号转换。每20um，超声波就要产生，超声脉冲扫描与高速位置检测扫描相一致。高速位置检测器可以直接监测运动阶段位置编码，数据获得和扫描由同一个电脑控制，在所有的标本中，一个8×8mm以针为中心扫描。
扫描之后，初始数据形成致最后形成图像，每张图像像素与对应的脉冲波相一致。像素的灰度值被设置为线性相关的接受到脉冲波射频信号的峰值。对应于8×8毫米位图图像灰度级图像（行列）从而创建。每个像素代表约20×20um的组织区域。
Fourier变换分析
Fourier变换分析是用来测试的声学图像的周期性，如图5A所示图像主要有缺乏相关图案的灰阶点组成，在图5B和6A上清晰的看到螺旋状图案。周期性检测需要对图像上形态图案进行数学和统计上的分析。螺旋状的图案显示周期性是从螺旋中心向周围放射。因此我们建立极坐标(ρ,θ)。对每张图像，针灸针所在的位置成为极点，八个θ对应的极轴（θ=0°,45°,90°,°,°,°,°,°），每行测量3.4毫米，包含个数据点。研究者对Fourier变换分析采取盲法。在空间频率谱，峰值可能出现在特定的空间频率对应于在图像中形成的一定的空间周期。反映的主导周期性的峰值作为该行的结果测量。
数据处理方法
受试者
受试者随机分为三种不同的针刺手法（针刺无旋转组、针刺单向旋转组、针刺双向方向旋转组），每种手法独立分析。重复变量分析用来评价四个针刺点（L、L+1、D、D+1）起针阻力的差异。采用Fisher.sLSD在适当的时候进行成对地比较。构建线性对比度用来检测增加腰部针刺深度是否比在骶部产生更大起针阻力。对应起针阻力的数据进行对数转换后分析，以满足方差分析有关的方差假设的正常性和同质性。
活体动物实验
配对t检测用来比较针刺单向捻转组与无捻转组起针阻力和体积测量，并分析两组之间的相关性。
大鼠组织超声图像之间的Fourier分析
我们使用多次离散分析评估针刺单向捻转组与无捻转组间的差别。处理条件之间的差异F检验利用大鼠X处理条件作为误差项，统计分析采用SAS统计软件。
实验结果
人体实验起针阻力测定：
起针阻力测量的数据在表格1和图1中表示，在四个针刺点三种不同的针刺手法表现的起针阻力明显的不同(RepeatedMeasuresANOVA,NO:F3,57=48.0,P0.;BI:F3,54=15.7,P0.;UNI:F3,57=12.7,P0.).。
在针刺D+1点起针阻力总比D大，除了在腰部的一个针刺点，差别都具有统计学意义。
在腰部的针刺差别ΔL对应着针刺入肌肉的1cm，在骶部针刺深度ΔS差异致起针阻力的区别于针刺入皮下组织1cm相关。如图1A。对于针刺双向旋转组和无旋转组，没有证据表明，在腰部针刺深度不同致起针阻力的差异ΔL比ΔS大，但针刺单向旋转组，ΔS明显大于ΔL，在针刺深度D和D+1导致的起针阻力差异很大，其针都未针刺入肌肉。如图1B
活鼠起针阻力和结缔组织体积测量
针刺单向捻转时起针阻力（均数±标准误）为2.48±0.39N，而针刺无捻转组为0.17±0.01N(配对t-test,T12=5.9,P0.)，如图3A。这些区域的组织学检测与先前观察的结果无明显区别，我们发现捻转组针体周围致密结缔组织明显的增厚如图4。相关致密结缔组织体积明显增多，单向针刺组为1.01±0.11mm3，针刺无旋转组为0.5±0.06mm3，(配对t-test,t10=5.0,P0.)如图3B。在针刺单向旋转组起针阻力与结缔组织体积呈正相关(r=0.78,P0.01)，在针刺无旋转组未发现明显关联(r=0.47,P=0.14)。
图3
图4（A无捻转组，B为单向捻转组，针灸针周围组织体积明显增大。双向箭头示）
大鼠组织体外超声图像
大鼠组织标本的超声图像如图5，其中5A是针刺无旋转组，5B是针刺单向旋转组，在图6表示的是另一样本的声学图像和光学图像（请看附录），在每张
声像图上中心的位置可看到代表针灸针的黑点。在单向捻转组的每张声学图上，可看到螺旋状图案，而在针刺无捻转组看不到螺旋状图案。在所有的图像上，由傅里叶变换系统产生的峰值对应的波长范围从0.2到1.7毫米/周期，在单向捻转组，灰阶图像上的方差值28.7±2.2，而针刺无旋转组为22.0±1.4，（重复测量的方差分析，F1,7=9.6，P=0.），如图5C。
图5
讨论：
这项研究结果强烈支持结缔组织盘绕是针刺手法诱导的起针阻力量增加的机制，我们没有证据表明针刺肌肉导致起针阻力比针刺皮下组织大。事实上，针刺入皮下组织进行单向捻转导致起针阻力远比针刺入肌肉大得多。我们还发现在活鼠腹部针刺施行单向捻转手法后，起针阻力与皮下致密结缔组织体积比未施行捻转手法多。这些结果表明滞针可以在活体动物上测量，动物组织标本观察到的结缔组织变化也会发生在活体上。我们最终发现单向旋转鼠皮下组织超声表现为环形图案，而无旋转组则不会形成。超声图是各种组织如胶原蛋白、脂肪之间的界面产生的。螺旋形图案表明针体周围结缔组织盘绕形成螺旋有序物引起组织成分重构，皮下组织盘绕与我们先前实验观察一致，单向捻转增加了针与组织之间的耦合，然而双向捻转时皮下结缔组织盘绕发生了变化，针与组织间的耦合较小。
结缔组织盘绕针灸领域相关的机制，也是机械信号转导和结缔组织生理学领域的一种机制。小直径轴周围材料进行性盘绕致摩擦力量的增加，使绕制一个理想的机制，获得一个仪器（针）和组织之间的紧密机械耦合的理想机制。形成的这种机械耦合，针体捻转就会向组织内传达很强的机械信号，在过去的十年中，细胞和分子对机械应力反应一直是激烈和取得富有成效的研究主题。机械力可以通过细胞外基质和细胞骨架间的黏着物传递至细胞膜上。细胞对机械刺激的反应包括细胞形变、信号传导路径激活、基因表达。对动力传导的大多数研究都在组织文化环境中进行。在这项研究中，我们已经证明，捻转针灸针会导致可测量的结缔组织形变。牵拉的胶原蛋白和/或在针操作过程中的细胞外基质的弹性纤维和变形可能会对局部细胞有强大持久的影响，包括细胞外基质成分的合成和释放和间质结缔组织组成修改。这样的细胞外基质的变化反过来可能会调节结缔组织细胞的机械信号转导效应。
我们的研究对理解针灸将有重大的影响，在过去的30年中，针灸研究的一般假设一直是针灸的治疗效果基本上是通过神经系统来进行的。这个观点是由早期的实验表明，针刺手法的镇痛作用是通过阻断支配深部组织的感觉神经，并且观察到许多穴位位于感觉神经和神经肌肉接头处。针灸治疗的神经效应已被证明，如中枢神经系统释放内源性镇痛物质、自主神经系统反射的激活、功能磁共振发现脑结构变化。本研究通过皮下结缔组织参与滞针的证据，表明针刺作用机制涉及神经外组织，对针刺操作局部细胞和分子作用的进一步研究铺平了道路。
本研究的结果也显示在神经调节方面间质结缔组织中有重要作用，皮下结缔组织在体内形成一个整体，结缔组织的平面与真皮是连续的，有间隙的平面，分离肌肉，骨骼，肌腱和肌内结缔组织。针刺技术效果，可以通过神经刺激，但也通过周围感觉神经传入纤维结缔组织变化产生。结缔组织的变化可以是长时的，这也可以解释针灸的延时效果。
在本研究中，我们采用的针刺点不是传统意义上的针灸穴位，人体腰骶部和动物实验中针刺点是标准化测量所得，而传统针灸穴位是通过解剖标志骨度分寸法定位出来的，因此在本实验部分受试者中，针刺点可能与传统针灸穴位重合。我们先前报道在传统针灸穴位起针阻力比相对应的非针灸穴位大18%，然后针刺手法上的不同造成的效果差别更大，单方向旋转起针阻力增加%，双向选装起针阻力增加52%。此外先前研究表示，无论在针灸穴位还是非针灸穴位，针刺手法可以显著增加起针阻力。针灸穴位往往沿着肌肉间、肌肉骨骼间、肌肉韧带间的分裂面分布的，因此目前表明滞针涉及结缔组织的数据与这些结论是相吻合的，针灸穴位上的滞针通常要大一些。
总而言之，这项研究结果表明滞针不是由于肌肉收缩所致，同时表明针体捻转导致起针阻力增加和可测的皮下结缔组织结构变化。我们研究结果支持结缔组织缠绕和针体与结缔组织耦合形成致生物力学和组织结构的变化。生物力学传导领域越来越多的证据表明机械刺激可以导致广泛的细胞内外事件，这些事件通常包括细胞形变、基因表达、细胞外基质改良。因此，针刺手法导致的结缔组织细胞外基质的变形或许是针灸延时疗效和远端取效的基础。这些结果需更进一步的研究，可能有助于理解针灸基础和组织内机械力效应。
附录
声学图像特征
通常，生物组织的声学特性比相对应的光学图像表现出较大的对比度，因此声学图像不用组织染色技术就能方便获得。声学图像对比度与组织阻抗有光，声阻抗可以定义为物体密度和媒介中声传播速度。如果一个物体有A和B两种材料组成，A距传感器比B更近，在垂直探射条件下，传感器产生声波经A达AB界面，在声波达到B前，有部分声波从AB界面反射回来。在其他条件相同情况下，反射回来的声波强度取决于AB间声阻抗的差异。例如，脂肪、肌肉、胶原蛋白的声阻抗分别是、、Kg/(m2s)；在近垂直探射下，在肌肉胶原、肌肉脂肪、脂肪胶原界面反射回来的声波比例分别是0.19%、0.87%、1.9%，在三种界面中，脂肪胶原界面反射到传感器的声波能量最大，而肌肉胶原间反射回来的声波能量最小。如果物体是均匀各向同性材料，从组织散射的信号朝着各方向漫射，因此散射的信号能被传感器接收的很少。在这项研究中所采用的声学系统产生的声像图平行分辨率和垂直分辨率分别为60um、80um。
Figure6.Acousticandopticalimagesofsubcutaneoustissuewithunidirectionalneedlerotation.A)Freshtissuesampleimagedwithultrasoundscanningacousticmicroscopy;(B)thesametissuesamplewasformalin-fixedafterultrasoundimaging,embeddedinparaffin,sectioned,andstainedforhistologywithHematoxylin/Eosin.Scalebars:1mm.
大鼠腹壁组织声学图像如图6A，光学图像如图6B，在组织标本表面下0.35mm深度通过一个0.12us数据收集门就可以获得声像图；光学图像的获得要经下列几个过程，超声扫描之后即使固定在10%福尔马林溶液中，石蜡封包处理，以平行超声扫描面10um厚度连续切片，再HE染色。在声学图像、光学图像上的图案相似性说明，清晰的声学界面与光图像上脂肪胶原界面丰富的区域相对应。
另一个发现就是在声学图像上针孔比在光学图像上大一些，因为超声波被针体强烈地反射回来，所以在声学图像是针时黑色的，且和组织表面相平。因此在信号收集门内，信号小到可以忽略不计。因为超声聚焦在组织样本表面0.35mm深度，金属针具应该在聚焦区域的前方。这项结果也与针体在声像图上比实际针体直径大一些相一致。在光学图像上效圆孔表示的组织样本固定后针拔出遗留的针孔。
感谢
这项研究得到美国国立卫生研究所替代医学中心基金（RO1AT33和R21AT）的资助，佛蒙特大学一般临床研究中心的弗莱彻艾伦的医疗保健由NIH资助实施了本实验的人体试验。
我们感谢GaleA.Weld招募志愿者，感谢GaryJ.Nelson、AdamD.Reisner本研究绘图，感谢RobertW.Hamill,、MargaretA.Vizzard、MarilynJ.Cipolla为本研究的原稿做出指导。
原文：
有治好白癜风的吗根治白癜风
