冬眠是动物应对冬寒冷、食物短缺以及其他不利条件所采取的一种策略，许多变温动物在冬季进入冬眠，在冬眠期间动物的新陈代谢率会受到强烈的抑制，身体状态、心血管功能以及各组织的基因表达模式等会发生显著的变化，从而使它们节省大量的能量损耗以保证其能够在冬季存活。此研究以扬子鳄为研究对象，作者采集了冬季和夏季时期的扬子鳄组织（肝、脂肪、心肌、骨骼肌、脑、下丘脑、脾、肾、肺、小肠和甲状腺）和血清（图1），利用mRNA-seq，亚硫酸氢盐测序法（BS-seq）、小RNA测序（sRNA-seq）和iTRAQ/TMT蛋白分析，来探索爬行动物冬眠背后的遗传和表观遗传机制。
研究背景扬子鳄（Alligatorsinensis）是中国特有的极度濒危淡水鳄鱼，在万至万年前从美洲短吻鳄（密西西比短吻鳄）分化而来。两种短吻鳄的栖息地都较其他其它鳄鱼的栖息地冷，纬度更高。扬子鳄通常在10月下旬停止进食并进入冬眠，3月下旬环境温度回升时出眠。在此期间，它们的代谢受到强烈抑制，除非受到干扰，否则它会持续冬眠。表观遗传机制在各种生物过程中介导基因与环境的相互作用。DNA甲基化是真核生物基因组中一种古老的表观遗传修饰，在各种生物过程中发挥重要作用，包括基因表达、发育和应激反应的调控。DNA甲基化的水平和模式通常因物种和细胞类型而异。一般启动子甲基化与基因转录水平负相关，而基因体中的甲基化与转录水平正相关。据报道，DNA甲基化在哺乳动物冬眠相关的基因表达调控中发挥着重要作用；然而，以前的研究主要集中在整体DNA甲基化水平的变化，或特定基因的甲基化。MicroRNAs（miRNAs）是另一种涉及冬眠的表观遗传机制。DNA甲基化与基因转录潜能有关，而miRNAs参与转录后调节。虽然动物miRNA在系统发育上是保守的，但季节性表达变化在物种甚至组织之间是不同的。冬眠的质量对动物是否能存活度过冬季有重要影响。除了人类狩猎和栖息地破坏之外，全球气候变化正成为扬子鳄的一个严重威胁，对许多其他冬眠动物也是如此。因此，探索季节性生理变化背后的基因调控网络，对揭示冬眠的变温动物如何克服其栖息地寒冷以及食物缺乏的冬季具有重要意义。
主要结果1.能量代谢在冬眠期间受到抑制比较冬季和夏季所收集的组织的转录组和血清蛋白质组发现两个季节转录组的变化与不同组织的生物学功能相匹配。
甲状腺激素的生物合成和诱导
下丘脑-垂体-甲状腺轴对新陈代谢的调节至关重要。在冬眠期间，下丘脑中的促甲状腺素释放激素基因（TRH）和甲状腺中的甲状腺激素生物合成途径均下调。KEGG通路分析显示，冬眠期间下调的差异表达基因(DEGs)中在甲状腺激素生物合成通路中显著富集。参与甲状腺激素生物合成的各种基因，包括促甲状腺激素（TSHR）、甘油三酯（TG）和（TPO），在冬季均受到抑制（图2A）。相应地，血清中甲状腺激素（T3、T4、游离T3和游离T4）、TG抗体和TPO抗体水平在冬季显著降低。血清样本的iTRAQ/TMT分析表明，“甲状腺激素信号通路”中的血管性血友病因子（VWF）、软骨寡聚基质蛋白（COMP）和肌动蛋白5（ACT5）在冬季显著下调。
消化、吸收和营养代谢
食物的消化和吸收主要发生在小肠，脂肪是在肝脏合成的胆汁酸的帮助下消化的。KEGG途径分析显示冬季下调的DEGs在“初级胆汁酸生物合成”（肝脏）、“脂肪消化和吸收”、“维生素消化和吸收”和“矿物质吸收”（小肠）通路中显著富集（图2B和图S1A，表S2）。在消化和吸收相关通路中，下调的DEGs多于上调的DEGs（图S1）。这些结果表明冬眠期间小肠的消化吸收和肝脏的胆汁酸生物合成和分泌受到抑制，更加支持了冬季期间鳄鱼的禁食状态。
碳水化合物是动物的主要能量来源，通过糖酵解/糖异生、柠檬酸循环（三羧酸循环）和氧化磷酸化降解产生ATP。富集在这三种通路的冬季下调基因显著多于上调的基因（图2C）。脂代谢途径基因的表达在冬眠的扬子鳄中也普遍下调。在冬季雌性扬子鳄的脂肪和肝组织中，下调的基因显著富集在参与脂质代谢调节的信号通路上。但扬子鳄更多地利用肝脏中的脂肪酸（FAs）来维持其正常功能和代谢活动，同时通过减少利用心脏和骨骼肌中的脂肪来节省能量。氨基酸代谢的主要场所在肝脏。氨基酸代谢基因在扬子鳄冬眠期间普遍下调（图S2C）。
心肌和骨骼肌收缩
在冬眠期间，心跳速率降低，心肌收缩是一个由Ca2+内流启动的复杂过程。七个电压依赖性钙通道基因在冬眠中下调（图2D）。参与骨骼肌发育和编码慢收缩骨骼肌成分的基因受到了下调，而编码快收缩骨骼肌成分的基因则上调（图2E）。这些基因表达模式与作者以前的研究发现相一致，即扬子鳄在受到干扰并从冬眠中醒来时表现出自我保护行为，但很快就会平静下来并再次进入睡眠状态。
排泄和免疫
随着代谢基因的表达显著降低，在冬眠期间与肾功能相关基因的表达也受到了抑制。肾脏中很多下调的基因在KEGG途径“收集导管酸分泌”和“近端小管碳酸氢盐回收”显著富集。包括编码CA2的基因，该基因催化二氧化碳的可逆水合作用；SNAT3、GLS和GLUD，负责运输和催化谷氨酰胺产生NH4+；以及近端管状细胞（NBC1、ATP1、ATP1B和AQP1）和集合管闰细胞（AE1、KC4、CLCNKB和7种ATPases）中的许多跨膜转运蛋白，这些蛋白通过尿液、细胞质和血液转运离子。此外，参与水、钙和钠的重吸收的各种基因也被下调，包括AQP2和ENACA、ENACB和ENACG，以及调节Ca2+通道表达和顶端丰度的蛋白产物VDR、PTHR和KL（图2F）。这些结果表明在冬眠期间扬子鳄的肾功能受到了抑制。
脾脏是最大的免疫器官，储存着许多巨噬细胞和淋巴细胞，冬季脾脏中下调的DEGs在参与免疫和造血的KEGG途径中富集。尤其是下调的DEGs里有对淋巴细胞生成至关重要的基因（图2G），表明淋巴细胞的增殖在冬眠期间受到抑制。各种编码溶酶体酸水解酶和溶酶体膜蛋白的基因均显著下调。编码吞噬体成分的基因下调，表明在冬眠期间免疫细胞的吞噬作用受到了抑制。此外，各种在冬季下调的DEGs还与传染病有关。此结果表明扬子鳄选择冬眠的场所外源性病原体较少，免疫和造血受到抑制以节省能量消耗。
2.冬眠期间受到正向调节的因子在扬子鳄冬眠期间，发现了几个显著上调的因子。冷诱导的RNA结合蛋白基因（CIRBP）的表达可以简单地通过冷胁迫来诱导。几乎在所有的组织中，CIRBP的转录都受到积极上调，特别是在大脑、甲状腺、肝脏、小肠、脂肪组织、肾脏、心脏和骨骼肌中。这些结果表明，CIRBP在变温动物的冬眠中起着关键的作用，虽然尚未被完全阐明。神经活性标记基因在冬眠期间也在除甲状腺外的大部分中枢和外周器官中高表达，表明扬子鳄在冬眠期间的神经处于活跃状态，并在冬眠期间进行正向调节。此外，一般转录因子（GTF）基因通常在冬季被激活。因此，冬眠期间参与甲状腺激素生物合成、营养吸收和代谢、尿排泄和免疫的基因的下调可能不仅仅是通过GTF基因抑制来调节，而是通过更具体和复杂的途径来调节，如DNA甲基化和miRNAs。
3.扬子鳄冬眠期间的DNA甲基化状况作者用BS-seq法在每个组织样本中鉴定出平均24.43M的甲基化胞嘧啶（mCs），占扬子鳄胞嘧啶（Cs）的2.49%。大多数mCs（96.66%）位于CpG岛（胞嘧啶(C)-磷酸(p)-鸟嘌呤(G)）中（图3A），而CHG和CHH环境中的mCs非常少，其甲基化程度大大降低（图3A和3B）。与在其他脊椎动物中的发现相一致（图3C）。在转录区域和这些区域的上下行~2kb范围内，启动子区的CG甲基化水平最低，在转录起始位点（transcriptionstartsite,TSS）处甲基化水平逐渐下降到最低水平，然后在50UTR处再次升高。CG甲基化水平在外显子和内含子区域最高，但在30UTR区域略有下降（图3D）。这些结果表明，DNA甲基化可能参与转录起始的调控。
4.基因甲基化状态与基因表达的相关性mRNA-seq数据与相同组织的BS-seq数据进行联合分析发现启动子CG甲基化与基因表达负相关。至于基因体及其下游的CG甲基化中，未表达基因的DNA甲基化水平最低，而中度表达基因的甲基化水平最高（图4A）。基因体甲基化水平最高的基因（图4B中的第四组和第五组）往往是中度水平表达。这些结果表明启动子甲基化与转录抑制有关，而基因体甲基化在基因过度表达的正常化中起作用。作者鉴定了冬夏样本间的差异甲基化基因（DMGs）。发现除了肾脏（图4C）以外，DEGs在大多数组织中的DMGs显着富集（图4C），表明DNA甲基化确实调节转录，但其作用要复杂得多，例如，在冬眠期间，肝脏中有45个基因被高甲基化且下调，而31个基因被低甲基化并上调。但也有31个高DMG和46个低DMG分别被上调和下调（图4E）。
5.冬眠期间转录因子（TFs）及其调控网络的甲基化变化将有季节差异的甲基化基因（DMG）进行GO分析，结果显示，在几乎所有组织中，具有季节差异的DMG在涉及基因表达和代谢过程调节的通路中显著富集（图5A）。在扬子鳄基因组中鉴定了个转录因子（TF）基因，并分析了它们与每个组织中季节性差异甲基化基因（DMGs）的关系。观察到的差异甲基化TFs与DMGs的比率比预期还要高(1，/27，)（图5B），表明参与基因表达调控的基因，尤其是TF基因，更有可能发生差异性甲基化。
6.冬眠期间miRNA的调控将脂肪、脑、心脏、小肠、肌肉和性腺组织进行了sRNA-seq，以确定季节性差异表达的miRNA（DEmiRs）。一些与冬眠相关的miRNA是保守的。例如，miR-、miR-(大脑)和miR-（骨骼肌）在冬眠的扬子鳄中上调（图6A），并在冬眠的小棕色蝙蝠（Myotislucifugus）的相应组织中也有报道。此研究还发现了新的与冬眠相关miRNA，其中一些是扬子鳄特有的（图6A）。miRNAs在基因表达调控中的作用具有组织特异性。冬眠期间，它们在不同组织中的表达水平不同（图6B-6D）。此外，表达模式表明一些miRNA的作用是具有物种特异性的。MiR-a在冬眠的扬子鳄的脂肪组织中下调，但在冬眠的十三地线松鼠（Ictidomystridecemlineatus）中上调。MiR-1a在几种冬眠动物的肌肉中上调，但在扬子鳄中却没有发现。此研究还预测了季节性差异的miRNA（DEmiRs）靶基因。与脂肪消化和吸收有关的miRNA靶向基因DGAT1、DGAT2、APOA1、APOA4、APOB、ABCG8、CD36、MTTP1、MTTP2、FABP2和SCARB1在小肠中被下调(图6E)，和与脂质代谢相关的LPL，FATP6，SCD，和GOT2，在冬眠期间的脂肪组织中被下调(图6F)。表明一个基因可以被多个miRNA调控，同样，一个miRNA也可以靶向多个基因，从而形成一个复杂的调控网络。
重要结论此研究描述了扬子鳄在冬眠期间独特的节能策略，表明了冬眠的扬子鳄适应冬季禁食状态，抑制了与营养吸收和代谢的相关途径，得出了以下结论：（1）冬眠期间甲状腺激素的生物合成、营养吸收和代谢、肌肉收缩、尿排泄和免疫功能通路整体下调；（2）脂肪分解代谢被完全抑制，与肝脏脂肪酸转运蛋白CPT1A的上调相反，提示了一种不同于冬眠哺乳动物的独特的节能策略；（3）冬眠相关基因不仅受DNA甲基化直接调控，还受甲基化依赖的转录网络控制。此外，作者识别并比较了组织特异性、物种特异性和保守的季节性miRNAs，证明了冬眠期间复杂的转录后调节。揭示了扬子鳄冬眠的遗传和表观遗传机制，并为冬眠调控的进化提供了分子见解。
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