一种DM加重心肌I/R损伤的新机制
——功能异常的脂肪细胞和心肌细胞之间通过细胞外囊泡互相“交流”
.6.15-.6.21
一、文章信息
1.文章题目：SmallExtracellularMicrovesiclesMediatedPathologicalCommunicationsbetweenDysfunctionalAdipocytesandCardiomyocytesasaNovelMechanismsExacerbatingIschemia/ReperfusionInjuryinDiabeticMice
2.发表时间：.1
3.发表期刊：Circulation(IF=23.1)
二、主题解读
文章发现了一种DM加重心肌I/R损伤的新机制——病理状态下，功能异常的脂肪细胞和心肌细胞之间，通过小细胞外囊泡（SEVs）互相“交流”，加重心肌I/R损伤。
三、背景知识
细胞外囊泡（Extracellularvesicles，EVs）按照产生途径不同分为几类：
1.囊泡Ectosomes/微囊泡microvesicles/微粒microparticles：质膜起源
2.外泌体Exosomes：高尔基体膜包裹细胞内吞物质，形成多囊泡体，其膜和细胞膜融合，释放其中多个囊泡（外泌体）
3.大型囊泡、外驱体、其他大型细胞外囊泡
4.包膜病毒
5.外泌颗粒（exomeres）
小细胞外囊泡：1和2统称为小细胞外囊泡（SmallExtracellularMicrovesicles，SEVs）
四、主要结果
本文主要工作可以分成四个部分——
证明HFD喂养的小鼠脂肪细胞产生的SEVs促进I/R损伤；
探究并证实SEVs中起到促I/R损伤功能的分子是miR-b-3p；
探究miR-b-3p下游信号通路；
联系临床在人体组织中证实相应结论。
1.第一部分：证明HFD小鼠脂肪细胞来源的SEVs促进心肌I/R损伤
（1）HFD小鼠脂肪细胞来源的SEVs与心肌I/R损伤加重有关
作者取无糖尿病正常小鼠（ND），在预期结扎远端心肌处注射SEVs。在三个实验中，注射的SEVs分别为正常（ND）和高脂肪饮食（HFD）小鼠血浆总SEVs（Fig.1A-C）、ND和HFD小鼠脂肪细胞分离后提取的SEVs（Fig.1D-F）、ND小鼠脂肪细胞正常条件和高糖高脂环境体外培养后提取的SEVs（Fig.1G-I）。48小时后对小鼠进行冠脉结扎、再通手术。多普勒超声评价左室收缩功能，心脏解剖截面观察梗死区域面积，TUNEL染色评估心肌细胞凋亡率。
Fig.1A-C说明HFD小鼠血浆中SEVs对I/R损伤加重相关，表现为左室收缩力降低（±dp/dtmax降低）、心肌梗死面积增大、心肌细胞凋亡率升高。Fig.1D-F进一步说明是脂肪细胞来源的SEVs，Fig.1G-I进一步证实是高糖高脂（而不是缺氧等因素）使脂肪细胞产生与I/R损伤相关的SEVs。
PS：±dp/dtmax：左室收缩、舒张过程中ΔP/Δt最大值，反映左室收缩、舒张功能。
建立了HFD脂肪细胞SEVs与I/R损伤的invivo表型的联系后，作者在体外将ND、HFD小鼠脂肪细胞体外培养后提取的SEVs（荧光标记）与人内皮、人心肌细胞、新生鼠心肌、成年鼠心肌细胞一起培养，检测各种细胞摄取SEVs的水平，证实心肌细胞对HFD-SEVs摄取增加（Fig.2E）。并检测新生鼠心肌细胞体外模拟I/R损伤后细胞活性、LDL释放、caspase表达，证实HFD脂肪细胞来源的SEVs与心肌细胞活性、脂代谢紊乱、细胞凋亡有关。
至此，HFD小鼠脂肪细胞来源的SEVs和I/R损伤加重的表型（invivo和invitro）之间的联系（correlation）已经建立。但correlation不足以说明因果（causal）关系，所以作者下一步通过将ND、HFD小鼠附睾白色脂肪（eWAT）组织移植至eWAT缺陷小鼠体内和注射SEVsinhibitor的方法说明SEVs和I/R损伤的因果关系。
（2）HFD小鼠脂肪细胞来源的SEVs导致心肌I/R损伤加重
HFD小鼠的eWAT脂肪组织移植到eWAT缺陷小鼠中，在随后的I/R损伤中表现出心肌收缩力降低、梗死面积增大、心肌凋亡率高（与移植了ND小鼠eWAT的对照组小鼠相比）。而注射SEVsinhibitor（GW）则I/R损伤减轻。可以得出HFD脂肪细胞来源的SEVs导致I/R损伤加重的结论。
第二部分：证实SEVs中的miRb-3p是导致心肌I/R加重的原因
（1）探究SEVs中与心肌I/R损伤加重有关的成分
作者对HFD、ND小鼠血浆SEVs内容物进行RNA测序，得到HFD组SEVs上调的种miR、下调的种miR（Fig.4A-B）。使用其他文献或数据库样本数据，获得（HFD相关；脂肪细胞表达；DM患者循环中出现；与凋亡相关）共四类miR的交集，即mmu-miR-29a-3p、mmu-miR-b-3p、mmu-miR--5p（Fig.4C）。针对这三种miR进一步检测其在ND、HFD组小鼠间表达差异，其中mmu-miR--5p表达量无组间差异，mmu-miR-b-3p表达量差异最大，故锁定mmu-miR-b-3p为目标分子（Fig.4D-F）。
随后作者测定eWAT组织内、eWAT脂肪细胞、心肌中初级和成熟miR-b-3p表达量，并在第一部分所用的动物模型中测定心肌初级、成熟miR-b-3p表达量。结果显示心肌初级miR-b-3p无显著差异（即ND、HFD组小鼠心肌细胞转录产生的miR-b-3p量类似），但成熟miR-b-3p差异显著，说明HFD组小鼠心肌显著升高的miR-b-3p来源于从循环中摄取，而不是自身转录（Fig.4G-O）。
（2）HFD脂肪细胞SEVs中的miR-b-3p导致心肌I/R损伤加重
同理，找出miR-b-3p分子后进行因果关系论证。用miR-b-3p类似物作用于ND小鼠，I/R损伤加重（Fig.5A-D）；体外作用于心肌细胞，凋亡增加（Fig.5I;J-K）。miR-b-3p抑制剂效应相反（Fig.5E-H;M;N-P）。说明miR-b-3p是导致心肌I/R损伤的原因。
第三部分：探究miR-b-3p的下游通路
生信分析预测miR-b-3p靶基因，在miR-b-3p类似物作用的样本中验证，获得top4差异表达基因AMPKα1（Prkaa1）、AMPKα2（Prkaa2）、Birc6、Ucp3（Fig.6A）。随后对此展开一系列验证，包括在ND、HFD小鼠心肌中检验该4种基因表达量、用miR-b-3p类似物和抑制剂作用于细胞和SEVs，检测潜在靶基因表达量（Fig.6B-G）。最后将4个靶基因上miR-b-3p结合位点突变后检测miR-b-3p类似物作用下靶基因表达（Fig.6H-K）。
随后作者发现了一个有趣现象，miR-b-3p类似物降低Birc6、Ucp3表达，AMPKα1/2过表达可以恢复Birc6、Ucp3表达；但Birc6、Ucp3过表达不能恢复被miR-b-3p类似物降低的AMPKα1/2表达，说明miR-b-3P对AMPKα1/2是直接作用，对Birc6、Ucp3的作用是通过AMPKα1/2实现的（Fig.7A-D）。接下来作者分别在体内/体外验证了各靶基因过表达可以减轻SEVs/miR-b-3p类似物对I/R损伤的促进（Fig.7E-H）。
第四部分：联系临床
在DM患者心肌细胞中检测I/R水平、miR-b-3p靶基因表达。异常脂肪细胞来源的SEVs促进心肌I/R损伤，而miR-b-3pinhibitor可能成为未来阻断该效应的关键分子（与药物开发相联系）。
五、与结论相关的拓展
本研究证明DM小鼠脂肪细胞对心肌细胞的影响，有研究称心肌细胞也对脂肪细胞产生影响，脂肪细胞和心肌细胞间的“对话”形成正反馈加重心肌损伤。心肌细胞对脂肪细胞的影响及机制值得更进一步的探究。
与结论相关的另一个问题是脂肪细胞SEVs对心脏的内皮细胞是否有类似的促凋亡的作用。若本实验中异常脂肪细胞来源的SEVs与心脏血管相关表型有关，或许能将DM/HFD与冠脉微循环障碍联系起来。
