研究背景
一直以来，创伤或肿瘤消融引起的大量肌肉缺损损伤的修复都是一个重大的临床挑战。医学上常用自体肌肉皮瓣转移重建手术。然而，有限的自体肌肉移植和供体部位的发病率往往使这些过程复杂化。对此，生物工程构建骨骼肌结构将是修复大量肌肉缺损损伤的一种重要的方法。目前，3D生物打印技术已成为一种建造生物工程骨骼肌肉结构的有效工具，因为这个技术可以通过精确定位多种细胞类型、生物活性因子和生物材料，生成基于细胞的复杂结构模拟天然组织。曾使用3D生物打印技术开发了一种植入式的仿生人骨骼肌结构，在啮齿动物模型中证明了其治疗肌肉缺损损伤的可行性，但植入后8周，该结构缺损肌肉不能完全恢复，这可能是由于宿主神经的延迟整合所致。对于重建大量受损肌肉与恢复肌肉功能，生物工程骨骼肌组织的有效神经整合仍然是一项挑战。
周围神经系统通过建立神经肌肉接口(Neuromuscularjunction，NMJs)来支配原始骨骼肌组织，NMJs负责骨骼肌的存活、发育、成熟和收缩。失去神经的骨骼肌会失去收缩力，发生肌肉萎缩。生物工程骨骼肌结构，由培养的肌肉细胞组成，这些细胞同样需要与宿主神经系统快速整合，否则肌肉功能很难恢复。
工作简介
在本研究中，通过生物打印设计了神经细胞整合的人骨骼肌结构，具有人肌肉祖细胞(humanmuscleprogenitorcells，HMPCs)与人神经干细胞(humanneuralstemcells，HNSCs)。利用神经细胞整合的生物打印人体骨骼肌结构，来改善大量肌肉缺损损伤和功能恢复。本研究的重点是证明在生物打印的骨骼肌结构上神经细胞和预先形成的NMJs具有对肌肉发育、快速神经支配和功能改善的影响，并评估了神经细胞对肌肉细胞活力、增殖及其分化的影响。同时，对生物打印结构中的肌源性和神经元分化以及形成NMJs的能力进行了体外评估。最后，将生物打印结构应用于大鼠胫前(tibialisanterior,TA)肌肉缺损损伤模型，评估了肌肉组织重建和神经支配的功能。研究表明，神经成分和预先形成的NMJs释放神经营养因子（或神经营养素）和神经递质，促进了骨骼肌细胞的存活和分化。
图文导读
图1不同比例的人肌祖细胞(hMPCs)和人神经干细胞(hNSCs)的二维(2D)共培养。(a)在分化5天时，hMPCs培养（1：0）和共培养(hMPCs：hNSCs=：1)肌球蛋白重链（红色）/DAPI（蓝色）的免疫荧光；肌纤维结构a)hMPCs和b)共培养的hMPCs和hNSCs。(b-e)肌纤维形成的量化；(b)纤维长度，(c)纤维直径，(d)纹状肌纤维，(e)每个肌纤维的核。(f)二维共培养hNSCs的胶质和神经元分化。(g，h)乙酰胆碱受体(ACHR)聚集和神经肌肉连接(NMJ)形成（白色箭头）。(g)βIIIT（绿色）/AChR（红色）/MHC（灰色）和NF（绿色）/AChR（红色）/MHC（灰色）在2D共培养中的免疫荧光。(h)在hMPCs培养和2D共培养中AChRs（绿色）/MHC（红色）的免疫荧光。(i)每个区域的AChRs数，(j)共定位(每个区域上βIIIT+AChRs)。
图2人体骨骼肌结构的生物打印。(a)三种成分(含细胞生物墨水、聚己内酯(PCL)和牺牲生物墨水)用于定制的3D生物打印系统逐层打印。(b)使用生物打印结构3DCAD建模的设计构思。(c)去除牺牲模式后创建结构中的微通道，以保持印刷细胞的活力。
图33D生物打印人体骨骼肌结构的体外评价。(a)一种含有细胞的水凝胶、PCL和牺牲材料的打印路径。(b)含有hMPCs和hNSCs的生物打印结构。(c)在1天和7天仅含有MPC和MPC+NSC(:1)的生物打印结构中心部分的活/死染色图像。(d)打印后1天定量细胞活力。(e)仅MPC和MPC+MHC免疫荧光。(f)定量分析MHC肌纤维密度。(g)MHC+肌纤维在7天时平均长度。(h，i)分化神经元(H)βIIIT和胶质细胞(I)GFAP的免疫荧光。(j，k)在肌管上预模式的AChR（绿色）/MHC（红色)和NMJs的AChR（绿色）/βIIIT（红色）/MHC（紫色）免疫荧光。(l)仅构建MPC的AChR（绿色）/MHC（红色）免疫荧光。(m)每个区域的βIIITAChRs数量。(n)每个区域的βIIIT+AChR+NMJs数量。
图4将3D生物打印的人骨骼肌结构植入胫骨前(TA)肌肉缺损大鼠模型进行功能恢复后第4周和第8周。(a)TA肌肉重量。(b)强直性张力。
图5组织学检查。(a)植入后4周和8周3D生物打印结构的骨骼肌再生。(b)用MTS染色结果量化胶原沉积面积。
图6肌纤维的形成和成熟。(a)植入后4周和8周损伤TA肌MHC（红色）/人白细胞抗原(HLA，绿色)的免疫荧光。(b)每个区域MHC+肌纤维面积的量化。(c)HLA+肌纤维的定量。
图7神经整合3D生物打印骨骼肌结构。(a，b)植入后4周和8周损伤TA肌肉的NF（绿色）/ACHR（红色）/MHC（白色）和bNF（绿色）/ACHR（红色）/HLA（白色）的免疫荧光。(c)植入后8周的MPC+NSC结构βIIIT（绿色）/HLA（红色）的免疫荧光。(d)每个HPF的NMJs数的量化。(e)每个HPF的EChRs数的量化。(f)NMJ肌纤维。
图83D生物打印骨骼肌结构的血管化。(a)植入后4周和8周，血管性血友病因子(vWF，绿色)/α平滑肌肌动蛋白(α-SMA，红色)的免疫荧光。(b)每个HPF的血管面积量化。(c)每个HFP的血管数量化。
结论
通过生物打印开发了具有神经细胞整合的人骨骼肌结构，神经细胞成分有利于细胞的存活，增强肌源性分化，同时，在体外生物打印骨骼肌结构中肌纤维上诱导NMJ的形成，从而使大鼠TA肌肉缺损模型中的肌肉功能快速恢复。随着进一步的发展，这种NMJ预形成的具有加速神经支配能力的生物工程骨骼肌结构，可能成为一种修复大量骨骼肌缺损损伤的有效治疗方法。
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