黄勇1,2 吴爽1 李士通1 魏薇1 陈莲华1
1上海交通医院麻醉科；2医院麻醉科，上海
国际麻醉学与复苏杂志,,40(11):-.
DOI：10./cma.j.issn.-..11.
基金项目
国家自然科学基金面上项目（，）
ORIGINALARTICLES
本研究拟验证面肌和肢体骨骼肌对肌松药的药效学敏感性是否存在着不同，同时进一步探讨不同肌肉对肌松药的敏感性差异是否与烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的表达及其上游信号通路有关。
1 材料与方法
1.1 实验动物
20只雄性SD大鼠，体重~g，清洁级。
1.2 口轮匝肌和腓肠肌标本制备
每只大鼠麻醉后取左侧口轮匝肌和左侧腓肠肌，分别分为口轮匝肌组（20只）和腓肠肌组（20只）。玻璃分针分离面神经颊支和胫神经，分离出带有面神经的口轮匝肌和带有胫神经的腓肠肌，浸泡于Krebs液中，修剪成宽约1cm的肌条备用。肌肉标本在完成离体药效学测定后再用于后续试验。
1.3 离体药效学测定肌肉对罗库溴铵的反应
将带有面神经的口轮匝肌和带有胫神经的腓肠肌迅速置于充满Kreb液的37℃恒温浴槽中。肌肉的一端与张力换能器连接，将神经缠绕刺激电极，刺激强度15V，波宽0.05ms，频率0.1Hz，间隔时间5s。肌肉在完成基础最大肌张力振幅（MTA）测量后，采用累积给药的方法，依次获得0.01、0.1、1.0、2.0、5.0、6.0、7.0、10.0、12.0、15.0、20.0、30.0、40.0μmol/L的罗库溴铵浓度，每次追加罗库溴铵后平衡10min再进行刺激，每个浓度电刺激5次。
1.4 半数抑制浓度（IC50）计算
两组肌肉未加肌松药时的基础MTA数值作为对照值，加入肌松药之后的MTA数值与基础MTA数值之比用于药效学分析。采用GraphPadPrism6软件，选择four-variablelogisticsigmoidal量效曲线模型，用非线性回归拟合出罗库溴铵的量效曲线，同时计算罗库溴铵的IC50和量效曲线斜率。
1.5 免疫荧光染色
将肌肉标本固定后脱水，液氮速冻30s。将标本包埋后连续冰冻切片，片厚30μm。10%驴血清封闭后，分别加入抗β1亚基抗体、抗δ亚基抗体、抗ε亚基抗体、抗γ亚基抗体，同时加入抗神经丝蛋白（NF-）抗体，于4℃湿盒孵育过夜。PBS洗片后，分别加入β1亚基抗体对应的AlexaFluor结合的二抗、δ亚基抗体对应的AlexaFluor结合的二抗、ε亚基抗体对应的AlexaFluor结合的二抗、γ亚基抗体对应的AlexaFluor结合的二抗，同时加入NF抗体对应的AlexaFluor结合的二抗和AlexaFluor标记的α银环蛇毒素，室温避光孵育1h。PBS洗片后，抗荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜观察。
神经肌接头是神经纤维末梢与肌纤维膜形成的突触样结构，α银环蛇毒素是银环蛇产生的神经毒素之一，能够特异性地结合神经肌接头接头后膜肌纤维膜上nAChR的α1亚基，而AlexaFluor是一种绿色荧光二抗，因此使用AlexaFluor标记的α银环蛇毒素可以特异性地定位神经肌接头的接头后膜，在共聚焦显微镜下呈现为绿色荧光。NF-是构成神经细胞轴突中间丝的蛋白质，抗NF-抗体常用于定位神经的走形，因此其能用于定位神经肌接头的接头前膜神经纤维末梢。
1.6 肌肉和神经肌接头形态学分析
通过Image-ProPlus软件分析口轮匝肌和腓肠肌的肌肉横截面积（CSA）和运动终板面积（ESA），每块肌肉中至少有50个神经肌接头及对应的肌纤维用于分析，同时计算运动终板荧光强度。
1.7 RT-PCR检测两组肌肉中聚集蛋白（agrin）/低密度脂蛋白受体相关蛋白4（Lrp4）/肌肉特异性激酶（MuSK）和神经调节素1（NRG1）/表皮生长因子受体（ErbB）信号调节通路的关键因子mRNA含量
使用Trizol试剂从肌肉中提取总RNA。取1μgmRNA加入逆转录试剂，42℃反应60min，95℃反应5min获得cDNA模板。使用SYBRGreen进行扩增，反应条件如下：95℃预变性60s，95℃变性15s，60℃退火30s共40个循环，95℃延伸15s。以GAPDH为内参，腓肠肌与口轮匝肌之间的表达差异以2-△△CT表示。
1.8 Westernblot检测两组肌肉agrin/Lrp4/MuSK和NRG1/ErbB信号调节通路的关键蛋白含量称取大鼠肌肉组织，加入蛋白裂解液进行组织匀浆，离心后抽取上清液。按BCA法测定样本蛋白浓度，煮沸离心后得到上样液，30μg蛋白在10%分离胶上恒压电泳，然后转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭。分别加入agrin一抗、Lrp4一抗、MuSK一抗、MMP3一抗、ErbB2一抗、ErbB3一抗、ErbB4一抗，4℃摇床孵育过夜，加入辣根过氧化物酶耦合的二抗，室温摇床孵育1h，ECL发光后显影拍照，用QuantityOne图像分析软件进行半定量分析。
2 结 果
2.1 罗库溴铵对腓肠肌和口轮匝肌的药效学比较
在两个实验组中，罗库溴铵浓度依赖性地降低间接刺激下腓肠肌和口轮匝肌的单收缩张力。与腓肠肌组相比，口轮匝肌组罗库溴铵的量效曲线发生明显右移，IC50明显增大（P0.05，图1、表1）。罗库溴铵量效曲线的斜率两组之间差异没有统计学意义（P0.05，表1）。
2.2 腓肠肌和口轮匝肌nAChR各亚基的表达及神经肌接头形态学观察
腓肠肌和口轮匝肌的nAChR表达α1、β1、δ和ε4种亚基，并且这4种亚基表达位置均位于神经肌接头上，同时两种肌肉的nAChR均不表达γ亚基（图2A、B）。
通过Image-ProPlus软件分析两种肌肉各个亚基的荧光强度，发现口轮匝肌nAChR的α1、β1、δ和ε亚基的荧光强度与腓肠肌相比较差异无统计学意义，即两种肌肉nAChR密度一致。比较口轮匝肌和腓肠肌的CSA和ESA，发现口轮匝肌CSA和ESA均小于腓肠肌（P0.05，表2），但口轮匝肌在单位CSA上拥有更大的ESA（ESA/CSA，P0.05，表2），而两种肌肉的运动终板nAChR密度一致，因此口轮匝肌在单位CSA上表达了更多的nAChR。
2.3 腓肠肌和口轮匝肌agrin/Lrp4/MuSK通路mRNA和蛋白表达
与胫神经支配的腓肠肌相比，面神经支配的口轮匝肌中agrin、Lrp4、MuSK和MMP3的mRNA表达差异没有统计学意义（P0.05，图3A）。口轮匝肌agrin、Lrp4、MuSK和MMP3的蛋白表达与腓肠肌相比差异没有统计学意义（P0.05，图3B、C）。
2.4 腓肠肌和口轮匝肌NRG1/ErbB通路mRNA和蛋白表达
与腓肠肌比较，口轮匝肌中NRG1β、ErbB2、ErbB3和ErbB4的mRNA表达高于腓肠肌（P0.05，图4A）。此外，口轮匝肌ErbB2、ErbB3和ErbB4的蛋白表达也高于腓肠肌（P0.05，图4B、C）。
3 讨 论
在本研究中，罗库溴铵对面神经支配的口轮匝肌和胫神经支配的腓肠肌的IC50作为衡量两种肌肉对肌松药的药效学反应。实验结果显示，罗库溴铵对口轮匝肌的IC50数值大于罗库溴铵对腓肠肌的IC50数值，这说明面神经支配的肌肉相比于肢体神经支配的肌肉对罗库溴铵更不敏感。
本研究为PNMB用于临床提供了理论依据。本研究发现面神经支配的口轮匝肌相比于体神经支配的肌肉对肌松药不敏感，可以指导麻醉医师合理使用肌松药，对于神经外科手术中面神经诱发肌电位的监测具有重要的临床意义。
在本研究中，我们通过聚焦于ESA、肌纤维大小和nAChR亚基以探究口轮匝肌和腓肠肌对肌松药敏感性差异的可能机制。
我们研究发现口轮匝肌和腓肠肌的nAChR亚型表达一致，只表达α1、β1、δ和ε亚基而不表达γ亚基，并且亚基表达位置均位于神经肌接头上。尽管口轮匝肌和腓肠肌所有亚基的荧光强度即密度一致，但是由于口轮匝肌有着相对更小的CSA，所以口轮匝肌在单位CSA上的nAChR密度大于腓肠肌。
我们检测了口轮匝肌和腓肠肌中两条通路关键信号因子的表达，发现无论是在mRNA还是蛋白水平，两种肌肉的agrin、Lrp4、MuSK和MMP3的表达差异均没有统计学意义，说明agrin/Lrp4/MuSK通路可能并不是引起nAChR在口轮匝肌神经肌接头中高表达的原因。而NRG1β、ErbB2、ErbB3和ErbB4在正常口轮匝肌中的表达高于腓肠肌，说明NRG1/ErbB通路可能是引起nAChR亚基在口轮匝肌神经肌接头中高表达的原因。
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